病原体多重PCR联检测

检测项目

多重PCR引物设计：设计特异性引物以靶向多种病原体基因序列，检测参数包括引物长度18-25 bp、GC含量40-60%、退火温度55-65°C。

荧光探针设计：使用标记探针用于实时检测，检测参数包括探针长度20-30 bp、荧光染料类型、淬灭剂选择。

核酸提取效率：评估样本中核酸纯化效果，检测参数包括提取产量、纯度A260/A280 ratio 1.8-2.0、抑制剂残留。

PCR反应体系优化：确定最佳反应条件，检测参数包括Mg2+浓度1.5-4.0 mM、dNTP浓度200-400 μM、引物浓度0.1-0.5 μM。

热循环程序设置：控制温度梯度进行扩增，检测参数包括变性温度94-95°C、退火温度55-65°C、延伸温度72°C、循环次数35-45。

实时荧光监测：采集扩增曲线数据，检测参数包括阈值循环数Ct值、荧光信号强度、基线校正。

数据分析与 interpretation：使用算法分析结果，检测参数包括灵敏度95%、特异性98%、检测限10 copies/μL。

质量控制验证：包括对照样本处理，检测参数包括阳性对照Ct值范围、阴性对照无扩增、重复性变异系数<5%。

交叉反应测试：评估引物特异性，检测参数无非特异性扩增、无假阳性率。

重复性和再现性：评估检测一致性，检测参数包括批内差CV<3%、批间差CV<5%。

检测范围

临床样本：血液、痰液、尿液等人体分泌物，用于病原体诊断和监测。

环境样本：水样、土壤、空气颗粒物，检测环境中的病原体污染。

食品样本：肉类、乳制品、蔬菜水果，评估食源性病原体风险。

动物样本：组织、血液、粪便，应用于兽医疾病诊断。

植物样本：叶片、根系、种子，检测植物病原体感染。

空气样本：通过空气采样器收集气溶胶，监测空气传播病原体。

医疗器械：导管、植入物、手术器械，检测生物负载和灭菌效果。

药品原料：原料药、辅料，确保无菌和微生物安全。

化妆品：护肤品、化妆品成品，评估微生物污染水平。

研究样本：实验室培养细胞、微生物菌株，用于科学研究验证。

检测标准

ISO 15189:2012 Medical laboratories — Requirements for quality and competence

GB/T 19438.1-2004 禽流感病毒检测方法 第1部分：通用要求

ASTM E2884-13 JianCe Guide for Detection of Nucleic Acid of Salmonella in Environmental Samples Using Polymerase Chain Reaction

ISO 22174:2005 Microbiology of food and animal feeding stuffs — Polymerase chain reaction (PCR) for the detection of food-borne pathogens — General requirements and definitions

GB/T 4789.28-2003 食品卫生微生物学检验 核酸扩增技术检测食源性致病菌通则

ISO 20395:2018 Biotechnology — Requirements for evaluating the performance of quantification methods for nucleic acid target sequences

GB/T 30989-2014 病原微生物核酸检测通则

ASTM E1873-06 JianCe Guide for Detection of Nucleic Acid of Bacteria by Polymerase Chain Reaction

ISO 17025:2017 General requirements for the competence of testing and calibration laboratories

GB/T 37871-2019 医学实验室核酸检测质量要求

检测仪器

实时荧光定量PCR仪：用于核酸扩增和实时荧光信号检测，功能包括多通道荧光采集、温度梯度控制、Ct值自动计算。

核酸提取仪：自动化纯化核酸 from samples，功能包括磁珠法或柱式法提取、高通量处理、去除抑制剂。

微量分光光度计：测量核酸浓度和纯度，功能包括UV absorbance扫描、A260/A280 ratio计算、样本体积1-2 μL。

电泳系统：分析PCR产物大小和 specificity，功能包括凝胶成像、DNA条带可视化、分子量标记。

生物安全柜：提供无菌操作环境，功能包括HEPA filtration、气流控制、样本保护。

离心机：用于样本预处理和试剂混合，功能包括转速调节、温度控制、转子适配。

干浴器或水浴锅：精确控制反应温度，功能包括温度范围室温-100°C、模块化设计。