基因扩增辅助鉴定检测

检测项目

目标基因扩增效率检测：评估PCR反应中目标基因的扩增能力，计算方法为E=10^(-1/slope)-1，检测范围90%~110%，斜率绝对值要求1.8~2.2，反应体系需包含模板、引物、DNA聚合酶等成分。

扩增产物特异性分析：通过凝胶电泳或测序验证扩增产物是否为目标序列，凝胶电泳检测要求目的条带单一、无杂带，测序结果与参考序列同源性≥99%。

引物 dimer 形成检测：检测PCR反应中引物自身或相互结合形成的二聚体，采用琼脂糖凝胶电泳或荧光定量PCR法，二聚体条带亮度需低于目标条带的10%，或Ct值晚于目标基因≥3个循环。

荧光探针信号强度测定：用于实时荧光PCR检测，测定探针杂交后的荧光发射强度，信号强度需≥背景值的10倍，检测通道需与探针荧光基团匹配（如FAM、VIC、ROX）。

扩增循环阈值（Ct值）分析：反映模板初始浓度的关键参数，Ct值范围要求15~35，同一批次样本Ct值变异系数≤5%，空白对照Ct值需≥40。

核酸模板浓度定量：采用荧光定量PCR或数字PCR法，检测范围10^1~10^8 copies/μL，定量误差≤10%，模板纯度（A260/A280）需在1.8~2.0之间。

突变位点等位基因频率检测：用于基因突变检测，测定突变等位基因在总等位基因中的比例，检测下限≤1%（数字PCR法）或≤5%（qPCR法），结果需经重复实验验证。

扩增产物片段长度分析：通过毛细管电泳或凝胶电泳测定扩增产物的大小，片段长度偏差需≤2bp（毛细管电泳）或≤5bp（凝胶电泳），用于STR分型、基因缺失/插入检测等。

交叉污染监测：检测PCR反应中是否存在外源性核酸污染，采用阴性对照（无模板），若出现扩增产物则判定为污染，需更换试剂或优化实验流程。

逆转录效率检测：用于RNA模板的扩增（如RT-PCR），测定RNA逆转录为cDNA的效率，计算方法为cDNA产量与输入RNA量的比值，检测范围50%~100%，需使用已知浓度的RNA标准品。

热循环仪温度准确性验证：检测PCR反应中各步骤的实际温度与设定温度的偏差，变性温度（95℃）偏差≤±0.5℃，退火温度（50-65℃）偏差≤±0.3℃，延伸温度（72℃）偏差≤±0.4℃。

扩增产物浓度测定：采用紫外分光光度计或荧光计，检测范围20~2000ng/μL，浓度误差≤5%，纯度（A260/A280）需在1.7~2.1之间，用于后续测序或克隆实验。

检测范围

临床病原体筛查：包括新冠病毒（SARS-CoV-2）、乙肝病毒（HJianCe）、丙肝病毒（HCV）、结核分枝杆菌（Mtb）等病原体的核酸检测，用于疾病诊断和疗效监测。

微生物菌种鉴定：对细菌（如沙门氏菌、大肠杆菌）、真菌（如白色念珠菌、曲霉菌）等微生物的16S rRNA、JianCe序列进行扩增，实现种属水平鉴定。

肿瘤基因突变检测：检测肿瘤组织或血液中的基因突变（如EGFR exon19缺失、KRAS G12C突变），用于靶向药物选择和预后评估。

遗传疾病基因检测：对地中海贫血（α、β珠蛋白基因）、唐氏综合征（21号染色体三体）、镰刀型细胞贫血症（HBB基因）等遗传疾病相关基因进行扩增，用于产前诊断或携带者筛查。

食品微生物污染检测：检测食品中的致病菌（如 Salmonella、Listeria monocytogenes）、腐败菌，采用实时荧光PCR法快速筛查，缩短检测时间至24小时内。

农业转基因成分检测：对转基因作物（如转基因玉米、大豆）中的外源基因（如Bt Cry1Ab基因、CP4-EPSPS基因）进行扩增，符合农业转基因生物安全管理要求。

环境微生物监测：检测水体、土壤中的致病菌（如霍乱弧菌、志贺菌）、指示微生物（如大肠菌群），用于环境质量评估和污染预警。

法医DNA鉴定：对人类 STR 位点（如D8S1179、D21S11）进行扩增，实现个体识别、亲子鉴定，符合法医DNA检验标准。

药物基因组学检测：检测药物代谢相关基因（如CYP2C19、CYP3A4）的多态性，用于指导药物剂量调整，提高用药安全性和有效性。

动植物检疫：检测进出口动植物中的检疫性病原体（如非洲猪瘟病毒、番茄黄化曲叶病毒），防止外来物种入侵，符合动植物检疫法规。

生物制品质量控制：对疫苗（如新冠疫苗）、生物制剂中的核酸成分（如病毒基因组）进行扩增，验证产品的有效性和纯度。

干细胞鉴定：检测干细胞中的多能性基因（如Oct4、Sox2）表达，采用RT-PCR法，目的基因表达量需高于分化细胞≥10倍。

检测标准

ISO 22174:2020 分子生物检测 基因扩增法通用要求：规定了基因扩增检测的实验设计、试剂选择、结果判读等通用要求。

GB/T 38571-2020 新型冠状病毒肺炎实验室检测技术指南：针对新冠病毒核酸检测的样本采集、处理、扩增及结果报告的国家标准。

ASTM E2666-20 聚合酶链式反应（PCR）检测微生物的标准指南：美国材料与试验协会制定的微生物PCR检测标准，涵盖样本制备、扩增条件优化等内容。

GB/T 19495.5-2018 转基因产品检测 实时荧光PCR法：规定了转基因产品实时荧光PCR检测的方法和要求，用于转基因成分的定量分析。

ISO 15239:2002 动植物检疫 聚合酶链式反应（PCR）实验室操作规范：国际标准化组织制定的动植物检疫PCR实验室操作准则，确保检测结果的准确性和可靠性。

GB/T 21767-2008 食品中致病菌检测 实时荧光PCR法：针对食品中致病菌的实时荧光PCR检测标准，包括沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7等。

WHO Guidelines for Molecular Diagnosis of Infectious Diseases 2023：世界卫生组织发布的传染病分子诊断指南，涵盖PCR、qPCR等技术的应用和质量控制。

GB/T 32470-2016 核酸扩增检测用试剂质量评价要求：规定了核酸扩增检测试剂的质量评价指标，如灵敏度、特异性、重复性等。

CLSI M100-ED32 2022 临床实验室标准化协会 微生物学检测标准：包含微生物基因扩增检测的标准操作流程和结果解释。

FDA Guidance for Industry: Quantitative Real-Time PCR Assays 2021：美国FDA发布的实时荧光PCR检测试剂行业指南，指导试剂的开发和申报。

检测仪器

实时荧光定量PCR仪：用于监测扩增过程中荧光信号的变化，实现实时定量分析，支持4-6通道检测（匹配FAM、VIC、ROX等荧光基团），反应体系10-100μL，检测灵敏度可达1 copy/μL，升温速率≥3℃/s。

梯度PCR仪：可设置不同温度梯度（1-30℃跨度），用于优化引物退火温度，支持96孔板反应，变性温度95℃（偏差≤±0.5℃），退火温度50-65℃（偏差≤±0.3℃），延伸温度72℃（偏差≤±0.4℃），循环次数25-40次。

核酸提取仪：采用磁珠法或柱式法提取核酸，处理能力1-96样本/批，提取时间≤30分钟，核酸纯度（A260/A280）1.8-2.0，核酸产量≥80%（以标准品计算），支持血清、血浆、拭子等多种样本类型。

凝胶电泳系统：用于分离扩增产物，凝胶浓度0.8%-2.0%（琼脂糖），电压范围50-200V，电流范围10-100mA，电泳时间20-60分钟，支持紫外透射检测（波长254nm或365nm），用于观察扩增产物条带。

数字PCR仪：实现单分子扩增，绝对定量目标核酸，检测下限≤0.1%突变频率，反应体系5-20μL，分液器可将样本分成10,000-20,000个微滴，读取器通过荧光信号计数阳性微滴，计算浓度。

基因测序仪（Sanger法）：用于扩增产物的序列测定，读取长度≥800bp，准确率≥99.9%，支持双向测序，反应体系包含测序引物、DNA聚合酶、荧光标记ddNTP，用于验证扩增产物的特异性。

荧光光谱仪：用于检测荧光探针的发射光谱，波长范围400-800nm，分辨率≤1nm，灵敏度≥0.1nM，支持多通道检测，用于优化荧光探针的激发和发射波长。

生物分析仪：用于分析扩增产物的片段大小和浓度，检测范围25-10000bp，浓度范围0.1-1000ng/μL，分辨率≤1bp，采用微流控芯片技术，分析时间≤30分钟，用于评估扩增产物的完整性和纯度。

核酸电泳成像系统：结合凝胶电泳和成像，用于记录扩增产物条带，支持CCD或CMOS相机（分辨率≥500万像素），曝光时间0.1ms-10s，可自动分析条带大小和浓度，生成报告。

PCR扩增仪（常规）：用于目标基因的体外扩增，支持96孔板，变性温度95℃（保持30秒），退火温度50-65℃（保持30秒），延伸温度72℃（保持1分钟），循环次数25-40次，升温速率≥2℃/s，用于常规PCR反应。