真菌杀菌剂抗性分析检测

检测项目

抗性表型测定：通过离体或活体实验测定真菌菌株对目标杀菌剂的抗药性水平，以EC50（有效抑制50%菌丝生长或孢子萌发的药剂浓度）为核心量化指标，测定范围0.01~1000μg/mL，重复次数≥3次，结果变异系数≤15%。

抗性基因检测：采用PCR、qPCR或基因测序技术鉴定真菌菌株中已知的抗性基因（如β-微管蛋白基因突变、CYP51基因过度表达），检测灵敏度达到10拷贝/μL，特异性≥99%。

交叉抗性评估：测定抗性菌株对不同作用机制杀菌剂的敏感性，分析其交叉抗性谱，涉及药剂包括苯并咪唑类、三唑类、甲氧基丙烯酸酯类等，每项药剂设置5~7个浓度梯度。

抗药性稳定性分析：通过连续转接无药培养基，监测抗性菌株在无选择压力下的抗性保持能力，跟踪世代≥10代，抗性水平下降率≤20%视为稳定抗性。

杀菌剂敏感性基线建立：针对未接触过目标杀菌剂的敏感种群，测定其EC50值并建立敏感性基线，用于后续抗性监测的基准对比，样本量≥30个菌株。

抗性机制代谢分析：采用UPLC-MS/MS或GC-MS检测抗性菌株中杀菌剂代谢产物的种类及含量，分析代谢解毒途径（如氧化、共轭反应）对耐药性的贡献，代谢物分离度≥95%。

抗性菌株适合度代价评估：比较抗性菌株与敏感菌株在生长速率、孢子产量、致病力等生物学性状上的差异，生长速率测定采用菌丝干重法，孢子产量统计≥10个视野。

田间抗性监测：采集田间病样分离真菌菌株，测定其对常用杀菌剂的抗性频率，抗性频率=抗性菌株数/总测试菌株数×100%，每个采样点样本量≥20个。

药剂混配增效作用测定：采用共毒系数法（CTC）评估两种或多种杀菌剂混配后的增效、相加或拮抗作用，CTC≥120为增效，80~120为相加，≤80为拮抗，混配比例设置3~5组。

抗性遗传方式分析：通过杂交或回交实验分析抗性性状的遗传模式（核基因遗传、细胞质遗传或显性/隐性遗传），杂交后代分离比符合孟德尔遗传规律视为核基因遗传。

检测范围

农作物病原真菌：包括小麦赤霉病菌（Fusarium graminearum）、水稻稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）、玉米大斑病菌（Exserohilum turcicum）等，用于监测田间菌株抗性动态。

园艺植物病原真菌：如草莓灰霉病菌（Botrytis cinerea）、月季黑斑病菌（Diplocarpon rosae）、番茄晚疫病菌（Phytophthora infestans）等，为园艺作物病害防治提供抗性数据。

药用植物病原真菌：例如人参锈病菌（Cronartium ribicola）、黄芪根腐病菌（Fusarium solani）、金银花白粉病菌（Erysiphe honeysuckle）等，保障药用植物产量和品质。

果树病原真菌：如苹果腐烂病菌（Valsa mali）、柑橘炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）、葡萄霜霉病菌（Plasmopara viticola）等，指导果树杀菌剂合理使用。

蔬菜病原真菌：包括白菜霜霉病菌（Peronospora parasitica）、番茄早疫病菌（Alternaria solani）、茄子褐纹病菌（Phomopsis vexans）等，支持蔬菜产业绿色防控。

经济作物病原真菌：如棉花枯萎病菌（Fusarium oxysporum f. sp. vasinfectum）、烟草黑胫病菌（Phytophthora parasitica var. nicotianae）、茶树炭疽病菌（Colletotrichum camelliae）等，服务经济作物病害管理。

观赏植物病原真菌：例如菊花黑斑病菌（Alternaria chrysanthemi）、仙客来灰霉病菌（Botrytis cinerea）、百合枯萎病菌（Fusarium oxysporum f. sp. lilii）等，保障观赏植物品质。

土壤习居病原真菌：如镰刀菌属（Fusarium）、丝核菌属（Rhizoctonia）、腐霉菌属（Pythium）等土壤中的病原真菌，监测土壤中抗性菌株分布。

仓储病原真菌：如粮食仓储中的曲霉属（Aspergillus）、青霉属（Penicillium）真菌，预防仓储作物霉变及毒素污染。

人工培育真菌：如食用菌栽培中的竞争性杂菌（如木霉属（Trichoderma）、青霉属（Penicillium）），保障食用菌生产安全。

检测标准

GB/T 38082-2019 植物病原真菌抗药性检测技术规程 杀菌剂

ISO 21708:2019 植物保护 杀菌剂 真菌抗药性测定 实验室方法

ASTM E2586-20 真菌对杀菌剂抗性的标准试验方法

GB/T 23222-2008 农药抗性风险评估指南 真菌杀菌剂

ISO 11231:2017 植物保护 杀菌剂 对植物病原真菌的室内效力测定 菌丝生长抑制法

ASTM E1891-13(2018) 杀菌剂对真菌生物膜活性的标准试验方法

ISO 18763:2015 植物保护 杀菌剂 真菌抗药性监测 采样和处理方法

GB/T 31785-2015 农药室内生物测定试验准则 杀菌剂 第1部分:抑制菌丝生长试验 平皿法

ASTM E3031-16 真菌对杀菌剂交叉抗性的标准试验方法

GB/T 17980.139-2004 农药田间药效试验准则(二)第139部分:杀菌剂防治黄瓜霜霉病

检测仪器

真菌培养箱：具备恒温、恒湿及光照控制功能，用于真菌菌株的离体培养及抗性表型测定中的菌丝生长或孢子萌发试验，温度范围10~40℃，湿度控制精度±5%RH，光照强度0~10000lux可调。

超高效液相色谱-串联质谱仪（UPLC-MS/MS）：用于抗性基因表达分析及代谢机制研究中的代谢物分离与鉴定，分辨率≤1ppm，检出限≤0.1ng/mL，支持多反应监测（MRM）模式。

实时荧光定量PCR仪（qPCR）：用于抗性基因的定性及定量检测，可检测目标基因的拷贝数及表达量，灵敏度达到10拷贝/μL，扩增效率90%~110%。

生物显微镜：配备相差显微镜及数码成像系统，用于观察真菌菌丝形态、孢子萌发情况及药剂处理后的细胞结构变化，放大倍数40~1000倍，成像分辨率≥500万像素。

酶标仪：用于酶联免疫吸附试验（ELISA）检测抗性相关酶活性（如乙酰胆碱酯酶、谷胱甘肽S-转移酶），波长范围400~750nm，吸光度精度±0.001A，支持多通道同时检测。

高速冷冻离心机：用于真菌细胞破碎及核酸、蛋白提取，最大转速15000rpm，离心力21000×g，温度控制范围-10~40℃。

药剂喷雾接种装置：模拟田间喷雾条件，用于活体植株的杀菌剂抗性测定，喷雾压力0.1~0.3MPa，雾滴直径10~100μm可调，接种均匀度≥90%。

电子天平：用于精确称量杀菌剂及培养基成分，感量0.1mg，最大称量范围200g，重复性误差≤0.2mg。

恒温摇床：用于真菌液体培养及药剂处理后的菌丝体震荡培养，振荡频率50~250rpm，温度控制范围10~50℃，振幅20~50mm可调。

紫外分光光度计：用于测定真菌培养液中的菌丝体生物量（如OD600值）及代谢产物含量，波长范围200~800nm，吸光度范围0~2A，精度±0.002A。

高压灭菌锅：用于培养基、实验器材的灭菌处理，确保真菌培养及检测过程无杂菌污染，灭菌温度121℃，压力0.1MPa，灭菌时间≥15分钟。