螯虾诺如病毒RTPCR检测

检测项目

病毒RNA提取：分离螯虾样本中的病毒核酸。参数：提取效率≥95%，纯度A260/A280比值1.8-2.0，浓度测量范围1-1000ng/μl。

cDNA合成：逆转录RNA为互补DNA。参数：逆转录酶温度42℃，反应时间30分钟，产物稳定性-20℃保存。

引物设计：特异性靶向诺如病毒基因组。参数：引物长度18-22bp，熔解温度Tm值55-60℃，GC含量40-60%。

探针优化：荧光标记探针增强检测灵敏度。参数：FAM标记发射波长518nm，淬灭剂为BHQ1，探针浓度100-500nM。

PCR扩增程序：执行核酸扩增循环。参数：预变性95℃3分钟，变性95℃15秒，退火55-60℃30秒，延伸72℃30秒，循环次数40。

扩增曲线分析：实时监测荧光信号增长。参数：阈值设定在指数增长期，CT值计算精度0.5。

熔解曲线分析：验证扩增产物特异性。参数：温度范围65-95℃，升温速率0.1℃/s，熔解峰Tm值85-90℃。

阳性对照设置：使用标准病毒株验证反应体系。参数：CT值≤30，荧光强度增长斜率≥0.1。

阴性对照设置：排除污染和假阳性。参数：无模板对照CT值未检出，水对照荧光信号基线。

定量标准曲线：评估病毒载量。参数：标准品浓度梯度10^1-10^9copies/μl，线性相关系数R≥0.99。

灵敏度测试：确定最低检测限。参数：检出限≤10copies/reaction，重复性变异系数CV≤5%。

特异性测试：避免交叉反应。参数：非靶标病原体扩增阴性，空白对照无信号。

检测范围

新鲜螯虾样本：活体或未加工螯虾的组织提取物。

冷冻螯虾制品：低温存储的整虾或分割产品。

加工螯虾食品：煮熟、罐头或调味制品。

水产养殖用水：养殖池或循环水源样本。

养殖环境沉积物：池底淤泥或过滤残留物。

食品加工设备表面：接触螯虾的器械拭子采样。

包装材料：运输或零售用塑料、纸质包装。

饲料样本：水产养殖投喂的复合饲料。

零售螯虾商品：超市或市场销售成品。

污水排放样本：处理厂或养殖区流出物。

生物组织样本：螯虾内脏或肌肉匀浆液。

水源监控样本：河流或湖泊水体过滤物。

检测标准

ISO/TS15216-1食品中病毒检测方法。

GB/T4789.31食品微生物学诺如病毒检验规程。

ASTME2186分子生物学检测标准指南。

GB4789.40水产食品微生物检验规范。

ISO22119食品链微生物学PCR检测要求。

GB/T27403实验室质量控制规范。

检测仪器

实时荧光PCR仪：检测核酸扩增和荧光信号。功能：执行温度循环和实时数据采集，输出CT值和扩增曲线。

高速离心机：分离样本颗粒和沉淀核酸。功能：在RNA提取中处理样本，转速可达15000rpm。

核酸提取仪：自动化纯化病毒RNA。功能：集成裂解、结合和洗脱步骤，提高提取效率。

电泳系统：分析PCR产物大小。功能：验证扩增片段特异性，凝胶分辨率达100bp。

分光光度计：测量核酸浓度和纯度。功能：评估提取物质量，波长范围200-800nm。

恒温混匀仪：均匀混合反应体系。功能：维持恒定温度用于逆转录，控温精度0.5℃。

超净工作台：提供无菌操作环境。功能：防止样本交叉污染，空气流速0.3-0.5m/s。