细胞支原体检测

检测项目

直接培养法检测：采用液体培养基与固体培养基双阶段培养，培养周期14-28天，灵敏度≤10 CFU/mL

DNA荧光染色法：使用Hoechst 33258/DAPI染色，荧光显微镜检测，检出限1×10⁴ cells/mL

PCR定性检测：针对16S rRNA基因保守区设计引物，扩增片段大小270-520bp，检测限100拷贝/μL

qPCR定量检测：TaqMan探针法定量，标准曲线R²≥0.98，定量范围10¹~10⁶拷贝/μL

指示细胞培养法：Vero细胞共培养72小时，DAPI染色验证，灵敏度10 CFU/mL

酶活性检测：精氨酸脱羧酶活性测定，比色法检测吸光度OD570nm变化速率

代谢产物检测：气相色谱质谱联用(GC-MS)分析有机酸谱，特征峰保留时间偏差±0.5min

种属鉴定测序：16S rDNA全序列分析，测序覆盖率≥99%，一致性≥98.5%

抗生素敏感性：微量肉汤稀释法测定MIC值，浓度梯度0.125-128μg/mL

细胞株溯源检测：STR分型联合支原体筛查，STR位点检出率≥80%

膜蛋白免疫印迹：Western Blot检测P48抗原，上样量20μg/lane

电子显微镜观察：负染色TEM检测，分辨率0.2nm，特征直径200-800nm

检测范围

细胞治疗产品：CAR-T细胞制剂、干细胞悬液等活细胞治疗物质的终产品放行检测

生物制药原料：重组蛋白表达用CHO细胞库、杂交瘤细胞主代库等三级细胞库鉴定

病毒疫苗基质：流感疫苗鸡胚尿囊液、vero细胞基质狂犬疫苗半成品检测

诊断试剂组分：ELISA试剂盒用酶标二抗、免疫组化用鼠腹水等生物源性材料

组织工程材料：皮肤替代物成纤维细胞层、骨修复支架接种细胞的质量监控

基因治疗载体：慢病毒/腺相关病毒包装用293T细胞培养上清的中间品控制

医疗器械浸提液：心血管支架涂层、人工关节润滑液中生物负载分析

细胞培养耗材：胎牛血清、无血清培养基等关键试剂的入场质控

原位杂交探针：FISH检测用核酸探针制备过程中的污染物筛查

微生物保藏菌种：标准菌株工作库的定期纯净度确认

器官移植保存液：肾脏机械灌注液、角膜保存液的生物安全性评价

检测标准

国际药典方法：Ph.Eur 2.6.7细胞培养法联合指示细胞培养法

美国药典标准：USP<63> Mycoplasma Tests中核酸扩增技术要求

ISO 17025体系：检测方法验证参数要求（特异性100%，假阴性率<5%）

ISO 11737-2:2019 生物负载检测的确认程序

中国药典通则：CP 2020 1101 无菌检查法补充要求

GB/T 34779-2017 实验动物 微生物学检测要求

GB/T 37871-2019 核酸检测试剂盒质量评价技术规范

YY/T 0607-2019 组织工程医疗器械产品支原体检测

FDA Guidance for Industry: Characterisation and Qualification of Cell Substrates

EP 5.2.3替代方法验证指南：等效性判定标准（Kappa≥0.75）

GB/T 19973.2-2018 医疗器械灭菌微生物学方法

检测仪器

实时荧光定量PCR仪：支持Taqman探针多重检测，温控精度±0.2℃，用于支原体DNA定量分析

全自动微生物培养系统：恒温振荡培养模块（37±1℃,120rpm），配套专用支原体液体培养基

倒置荧光显微镜：配备DAPI/FITC双通道滤光片，400倍率下进行染色阳性判定

凝胶成像分析系统：紫外透射波长302nm，灵敏度0.1ng DNA，用于PCR产物电泳验证

高通量测序平台：Illumina NovaSeq 6000系统，通量2Tb/run，完成16S rDNA全长测序

生物安全柜：Class II A2型，气流速度0.45m/s±10%，提供无菌操作环境

恒温CO₂培养箱：温度均一性±0.5℃，CO₂浓度控制范围5-20%±0.1%

多功能酶标仪：具备荧光/吸光度双模式，波长范围200-999nm，检测代谢活性

超低温冷冻离心机：最大离心力25,000×g，温度范围-10℃至40℃，用于核酸提取

电子显微镜：透射电镜分辨率0.34nm，加速电压20-200kV，观察细胞膜表面寄生结构