二代高通量测序检测

检测项目

核酸完整性检测：通过电泳及荧光定量分析RIN/DIN值，合格标准RIN≥7.0，检测精度±0.5单位

文库片段分布检测：采用微流控芯片技术分析200-700bp区间分布，峰宽CV＜5%

文库浓度测定：Qubit荧光定量检测标准范围0.1-100ng/μL，误差±5%

接头连接效率检测：qPCR扩增评估接头连接率，要求≥85%

GC含量偏倚分析：全基因组GC分布曲线比对，偏差阈值±10%

测序深度均匀度：连续100kb窗口覆盖度变异系数＜0.25

碱基识别质量值：Q30百分比测定，临床样本要求≥80%

重复序列率检测：PCR重复率控制标准≤20%

嵌合体序列筛查：采用双端定位法检出率≥99%

分子标签去重复：UMI识别准确率验证标准≥98%

突变检测灵敏度：低频突变检出下限0.1% VAF

序列比对率检测：参考基因组映射率要求≥95%

外显子覆盖均一性：目标区域覆盖深度差异＜3倍

交叉污染监控：样本间SNP一致性验证＞99.9%

检测范围

全基因组测序：人类30X深度全基因组分析，检测范围包括SNV/InDel/CNV/SV

全外显子组检测：覆盖＞99% RefSeq编码区，最小目标区域20Mb

肿瘤基因panel：定制化50-500基因组合，覆盖热点突变区域

转录组测序：链特异性RNA-Seq，检测灵敏度5FPKM

单细胞测序：10x Genomics平台单细胞捕获效率≥65%

宏基因组分析：环境微生物16S/18S/ITS扩增子检测

表观遗传检测：ChIP-Seq组蛋白修饰定位精度±50bp

循环游离DNA：血浆ctDNA检测下限0.5%等位基因频率

病原微生物检测：临床样本多重病原体并行筛查

法医DNA分析：STR分型及线粒体超变区检测

农业育种应用：作物SNP分型密度≥1个/Mb

遗传病诊断：孟德尔疾病相关基因致病突变筛查

微生物组研究：肠道菌群α/β多样性指数计算

药物基因组学：CYP450代谢酶多态性分析

检测标准

ISO/IEC 17025:2017 检测和校准实验室能力通用要求

ISO 20395:2018 分子体外诊断检测要求

CLSI MM19-A2 二代测序验证指南

GB/T 37872-2019 高通量测序数据质量要求

GB/T 30989-2014 核酸测序技术通则

CAP NGS验证指南2018版

FDA-NGS技术审查标准

EN ISO 15189:2022 医学实验室质量要求

YY/T 1723-2020 高通量测序仪行业标准

GB/T 34797-2017 基因检测数据存储规范

Illumina Sequencing Assay Design Tool规范

BAM文件格式规范v1.6

FASTQ文件质量编码Sanger标准

COSMIC数据库突变注释规范

检测仪器

Illumina NovaSeq 6000系统：双通道流动槽实现20亿reads/run产出，支持2x150bp双端测序

Agilent 4200 TapeStation：微流控芯片技术进行DNA/RNA完整性检测，灵敏度0.5ng/μL

Thermo Fisher Qubit 4.0：高精度荧光计实现0.1-100ng/μL核酸定量，CV值＜3%

Covaris M220超声破碎仪：聚焦超声技术控制DNA片段大小，碎片化精度±50bp

Nanopore GridION：纳米孔实时测序仪，支持超长读长（N50＞50kb）检测

Beckman Coulter Biomek i7：自动化液体处理系统，移液精度±0.5μL

Bio-Rad ddPCR系统：微滴式数字PCR验证低频突变，灵敏度0.001%

10x Genomics Chromium：单细胞捕获平台，单次运行通量＞10,000细胞

ABI QuantStudio 7 Pro：实时定量PCR仪进行文库质控，熔解曲线分辨率0.1℃

PerkinElmer Chemagic 360：全自动核酸提取系统，通量192样本/批次

Oxford Nanopore MinION：便携式测序设备，支持直接RNA测序

BioNano Saphyr：光学图谱系统，检测＞150kbp结构变异

Pacific Biosciences Sequel IIe：长读长测序仪，平均读长＞20kb