crispr/cas基因编辑检测

检测项目

脱靶效应全基因组分析：采用全基因组测序（WGS）结合生物信息学算法（如GUIDE-seq/CIRCLE-seq），检测范围覆盖>95%基因组区域，测序深度≥30X，灵敏度达0.1%变异等位基因频率（VAF）。

靶向编辑效率验证：通过Sanger测序与NGS靶向测序（扩增子测序），定量插入缺失（INDEL）频率，检测精度±0.5%，灵敏度阈值0.5% VAF，覆盖上下游50bp区域。

同源定向修复（HDR）效率检测：采用ddPCR/TaqMan探针法，定量等位基因转换率，动态范围0.01%-99.9%，绝对定量误差<±5%。

sgRNA活性与特异性验证：通过体外切割试验（如T7E1酶切）与荧光报告系统，测定切割效率及错配容忍度，可识别≥1bp错配的影响。

细胞活力与凋亡分析：基于流式细胞术（Annexin V/PI双染）及CCK-8检测，量化编辑后细胞死亡率，检测限为5%细胞群体变化。

大片段缺失与结构变异筛查：采用长读长测序（PacBio/Oxford Nanopore）及核型分析，检出>1kb的基因组重排事件，分辨率100bp。

表观遗传修饰检测：通过亚硫酸氢盐测序（BS-seq）及ChIP-qPCR，分析CpG岛甲基化水平及组蛋白修饰变化，覆盖度>90%靶区域。

载体残留与脱颗粒检测：运用qPCR检测gRNA/Cas9载体序列残留，灵敏度1拷贝/千细胞；ELISA法测定Cas9蛋白表达量，检出限0.1ng/mL。

功能性蛋白表达验证：Western Blot与质谱联用，定量目标蛋白表达量及翻译后修饰，动态范围3个数量级。

单细胞克隆基因型分型：通过微流控单细胞分离与多重PCR扩增，实现>98%单细胞捕获率及>95%基因型鉴定准确率。

细胞移植后嵌合体分析：采用STR多态性检测与SNP分型，定量供体细胞嵌合率，精度±0.1%。

脱氨酶活性检测：基于荧光底物法测定碱基编辑器活性，动力学参数Km值测定误差<±10%。

检测范围

基因治疗载体：慢病毒/AAV载体介导的CRISPR系统，验证载体整合安全性及编辑持续性。

T细胞免疫治疗产品：CAR-T/TCR-T细胞基因组编辑验证，包括TCR基因座敲除效率及PD-1调控区编辑。

基因工程动物模型：转基因小鼠/大鼠的基因敲除（KO）、条件性敲除（cKO）及点突变（KI）模型验证。

干细胞治疗产品：iPSC分化细胞系中致病基因修正，检测多能性标志物维持及分化潜能。

农业基因编辑作物：水稻/玉米靶基因修饰检测，包括抗病虫害基因插入及营养成分改造。

微生物工程菌株：工业酵母/大肠杆菌的代谢通路优化，验证基因簇插入稳定性。

体外诊断试剂盒：CRISPR-Cas12/13核酸检测试剂盒的灵敏度及特异性验证。

基因编辑工具酶：高保真Cas9变体（如HiFi Cas9）的酶切活性及保真度测试。

类器官疾病模型：肠/脑类器官靶基因编辑，验证病理表型重现性。

基因驱动系统：蚊媒种群控制基因驱动元件，评估驱动效率及抗性基因产生频率。

碱基编辑治疗产品：BE4max系统介导的致病点突变修复验证。

表观基因组编辑工具：dCas9-DNMT3a/TET1融合蛋白的靶向甲基化调控验证。

检测标准

ISO 21748:2017 分子生物学检测方法验证指南

ASTM E3028-18 基因编辑产物脱靶效应评估标准流程

GB/T 38502-2020 基因编辑产品通用技术要求

ISO 20395:2018 生物技术-核酸靶向测序技术要求

GB/T 37872-2019 基因编辑载体残留检测规范

ICH S6(R1) 生物技术产品临床前安全性评价

ISO 10993-1:2018 医疗器械生物学评价第1部分

GB 15193.3-2014 食品安全性毒理学评价程序

PFSB/ELD Notification No. 0407 基因治疗产品非临床研究指南

ISO 14644-7:2004 洁净室悬浮粒子控制要求

USP <1043> 细胞基因治疗产品检测要求

GB/T 35823-2018 干细胞制剂质量控制指南

检测仪器

Illumina NovaSeq 6000高通量测序系统：采用双通道SBS技术，单次运行通量6Tb，实现全基因组深度测序及低频变异检测。

Agilent 4200 TapeStation生物分析仪：配合高灵敏度D1000/HS D1000 ScreenTape，精确分析gRNA/Cas9核糖核蛋白复合物完整性。

Bio-Rad QX200微滴式数字PCR系统：基于微滴分区技术，绝对定量编辑效率，检测限低至0.001%等位基因频率。

Beckman CytoFLEX流式细胞仪：配置13色激光系统，同步检测细胞表面标记变化、凋亡率及细胞周期分布。

NanoString GeoMx Digital Spatial Profiler：通过原位寡核苷酸捕获技术，实现组织切片中编辑区域的空间多组学分析。

Oxford Nanopore PromethION 48：长读长测序平台（读长>100kb），精准解析大片段缺失及复杂结构变异。

Molecular Devices SpectraMax i3x多功能酶标仪：整合AlphaScreen/TR-FRET检测模块，定量Cas9-sgRNA复合物结合动力学。

10x Genomics Chromium X单细胞平台：完成>100,000个单细胞的转录组与基因组同步分析，鉴定编辑异质性。

Qiagen QIAcuity纳米孔数字PCR系统：基于微流控芯片技术，实现编辑效率的高通量并行检测（96样本/芯片）。

Zeiss LSM 900激光共聚焦显微镜：配备Airyscan 2超分辨模块（分辨率120nm），观测基因编辑对亚细胞结构的影响。