H3亚型流感病毒核酸检测

检测项目

HA基因片段、NA基因片段、M基因片段、NP基因片段、NS基因片段、PB2蛋白编码区、PB1蛋白编码区、PA蛋白编码区、血凝素受体结合位点、神经氨酸酶活性位点、抗原表位变异分析、HA1结构域突变监测、HA裂解位点序列、宿主特异性标记位点、耐药性相关突变（如S31N）、病毒载量定量分析、亚型特异性引物验证、交叉反应排除试验、内参基因（RNaseP）、阳性对照品验证、阴性对照品验证、扩增效率评估、熔解曲线分析、Ct值判定阈值、ORF完整性检测、移码突变筛查、混合感染鉴别诊断、进化分支聚类分析、毒力基因标记物、环境样本污染监测

检测范围

鼻咽拭子标本、口咽拭子标本、肺泡灌洗液标本、痰液标本、尸检肺组织标本、鸡胚尿囊液培养物、MDCK细胞培养物、环境空气样本（气溶胶）、医院污水样本、冷链运输拭子样本、禽类泄殖腔拭子标本、猪鼻腔拭子标本、马血清标本候鸟粪便样本实验动物肺组织病理切片禽类屠宰场环境样本医用防护服表面拭子生物安全柜台面拭子疫苗生产中间体样本质控品冻存管临床疑似病例咽漱液康复期患者血清标本重症监护病房空气过滤器宠物犬鼻腔分泌物野生动物呼吸道拭子食品冷链包装表面环境水体富集样本禽类交易市场笼具拭子实验室质控盲样

检测方法

实时荧光RT-PCR法：采用TaqMan探针技术对HA基因保守区进行双重靶标扩增，设置FAM/HEX双通道荧光标记系统；
数字PCR绝对定量法：通过微滴分割技术实现单分子核酸计数，适用于低载量样本的精准定量；
Sanger测序法：对PCR产物进行双向测序验证关键位点突变情况；
高通量测序（NGS）：采用Illumina平台进行全基因组深度测序以识别重组事件；
微阵列芯片法：利用预置探针同步筛查多种流感亚型及耐药突变；
逆转录环介导等温扩增（RT-LAMP）：适用于现场快速筛查的恒温扩增技术；
血凝抑制试验（HI）：配合核酸检测进行抗原特性验证；
焦磷酸测序法：针对已知突变位点进行高灵敏度定量分析；
多重连接探针扩增（MLPA）：用于大片段缺失或插入事件的检测；
电化学发光免疫分析法：联合核酸检测进行抗原抗体复合物验证；
数字微流控芯片技术：实现核酸提取与扩增的全流程集成化操作；
CRISPR-Cas12a快速检测法：基于侧向层析试纸条的便携式可视化检测。

检测标准

GB/T38580-2020流感病毒核酸检测通用要求
WS/T686-2020流感样病例暴发疫情处置指南
YY/T1717-2020核酸提取试剂盒质量评价技术规范
ISO15189:2012医学实验室质量和能力认可准则
CLSIMM03-A2分子诊断方法验证指南
WHOInfluenzaSurveillanceStandardsVersion2021.3
USCDCReal-TimeRT-PCRProtocolforInfluenzaA/H3
EP17-A2临床实验室检测限建立与验证指南
GB19489-2008实验室生物安全通用要求
ICHQ2(R1)分析方法验证技术要求
ISO/IEC17025:2017检测和校准实验室能力通用要求

检测仪器

实时荧光PCR仪（ABIQuantStudio7）：完成核酸扩增与实时荧光信号采集；
自动化核酸提取仪（KingFisherFlex）：实现磁珠法高通量核酸纯化；
生物分析仪（Agilent2100）：评估RNA完整性及纯度；
超低温离心机（Eppendorf5430R）：用于病毒灭活前处理；
全自动电泳系统（QIAxcelAdvanced）：快速分析PCR产物片段大小；
数字PCR系统（Bio-RadQX200）：绝对定量病毒拷贝数；
二代测序仪（IlluminaMiSeq）：完成全基因组深度测序；
生物安全柜（ESCOAirstream）：保障BSL-2级实验操作安全；
超微量分光光度计（ThermoNanoDropOne）：测定核酸浓度及纯度；
恒温金属浴（LongGeneLG-20）：维持逆转录反应温度稳定性；
微流控芯片阅读器（FluidigmBiomarkHD）：实现多重靶标同步检测；
真空浓缩离心机（EppendorfConcentratorPlus）：加速核酸干燥过程。