可变剪切差异分析与检测

检测项目

可变剪切差异分析主要包含以下核心检测项目：

转录本亚型鉴定：通过比对参考基因组识别特定基因产生的不同剪接异构体

剪接事件分类：系统区分外显子跳跃、内含子保留、可变供体/受体位点等7种经典剪接模式

差异表达定量：计算不同实验条件下各剪接异构体的表达丰度变化倍数

剪接效率评估：基于外显子连接点覆盖度数据量化特定剪接位点的使用效率

调控网络构建：整合转录因子结合位点与剪接因子表达谱的关联性分析

检测范围

本分析方法适用于以下研究场景：

疾病样本与正常对照组的剪接模式比较分析

不同发育阶段或细胞分化过程中的动态剪接调控研究

药物处理或环境应激条件下的剪接响应特征解析

肿瘤异质性相关的亚型特异性剪接事件筛查

模式生物遗传模型中的剪接调控机制验证

样本类型涵盖总RNA提取物（RIN≥7.0）、polyA+ RNA及单细胞悬液样本。分析通量支持从单个样本到大队列研究（n＞1000）的规模化数据处理。

检测方法

标准化的可变剪切分析流程包含三个主要阶段：

采用Ribo-Zero试剂盒进行rRNA去除处理（针对非polyA样本），构建链特异性文库（插入片段150-300bp），进行双端150bp测序（推荐测序深度≥50M reads/sample）

使用STAR进行基因组比对（参考版本GRCh38/hg38），通过rMATS（v4.0.2）识别差异剪接事件（FDR＜0.05），结合SUPPA2进行转录本定量（TPM≥1）。关键参数包括最小junction支持数（≥10 reads）、跨样本一致性检验（CV＜30%）

对候选差异事件进行RT-PCR产物电泳验证（胶回收条带测序确认），采用Nanostring nCounter系统进行靶向验证（Panel设计覆盖目标外显子连接区）

检测仪器

完整分析流程涉及的主要仪器设备包括：

Oxford Nanopore PromethION平台（用于全长转录本结构解析）

Qubit 4.0 Fluorometer（文库定量）

IBM Spectrum Scale并行文件存储系统（裸容量≥1PB）

Sage Science Pippin Prep自动核酸片段筛选仪（精确选择300-500bp产物）

检测流程

确定测试对象与安排：确认测试对象并进行初步检查，确定样品寄送或上门采样安排；

制定验证实验方案：与委托方确认与协商实验方案，验证实验方案的可行性和有效性；

签署委托书：签署委托书，明确测试详情，确定费用，并按约定支付；

进行实验测试：按实验方案进行试验测试，记录数据，并进行必要的控制和调整；

数据分析与报告：分析试验数据，并进行归纳，撰写并审核测试报告，出具符合要求的测试报告，并及时反馈测试结果给委托方。