抗病基因功能表达检测

检测项目

启动子活性分析：采用双荧光素酶报告系统检测调控元件活性，启动子截断体构建梯度≥5个，相对荧光值误差±5%

转录表达谱测定：基于RNA-Seq技术量化基因表达水平，测序深度≥20M reads/sample，差异基因筛选阈值|log2FC|≥1且p<0.05

蛋白质互作验证：酵母双杂交系统检测结合强度，阳性克隆需通过X-α-Gal蓝白斑筛选及AD/BD结构域对照验证

亚细胞定位观测：激光共聚焦显微镜跟踪GFP融合蛋白，定位精度达300nm，需设置空载体及细胞器标记蛋白对照

表观遗传调控检测：ChIP-qPCR分析组蛋白修饰富集度，抗体特异性验证H3K27ac/H3K9me3等修饰类型，富集倍数≥3倍判定有效

病原侵染响应曲线：离体接种测定病程相关基因表达动态，时间梯度设置6个以上采样点，RSD值≤15%

基因沉默效率验证：VIGS系统干扰靶基因后qPCR检测，沉默效率要求≥70%，表型同步记录病斑面积缩减率

蛋白磷酸化状态检测：Phos-tag™ SDS-PAGE分离磷酸化蛋白，迁移率偏移需经碱性磷酸酶处理验证

酶联免疫吸附定量：ELISA检测病程相关蛋白PR-1等含量，标准曲线R²≥0.99，检测限0.1ng/mL

转基因株系表型关联：T3代纯合株系接种发病率统计，抗病等级划分需满足病斑扩展抑制率≥50%

检测范围

农作物抗病育种材料：水稻抗稻瘟病Pi基因、小麦抗锈病Lr基因等转化株系的功能验证

模式植物工程菌系：拟南芥NPR1基因在青枯菌胁迫下的系统性获得抗性表达谱

果树抗病毒种质资源：柑橘CTV抗性基因CTR1在嫁接传毒体系中的表达稳定性评估

药用植物抗逆种质：丹参SmJAZ1基因对根腐病菌的功效成分合成调控检测

林木抗虫基因工程：杨树Bt毒蛋白基因在鳞翅目昆虫取食后的时空表达模式

微生物生防制剂：枯草芽孢杆菌抗菌肽ituD基因在植物根际的定植表达监测

水产抗病育种品系：鲤科鱼类IL-8基因对嗜水气单胞菌侵染的免疫应答强度

模式昆虫病原互作：果蝇Toll通路基因在白僵菌感染中的调控机制验证

食用菌抗病菌株：香菇几丁质酶Chi2基因对木霉拮抗作用的分子证据

基因编辑育种材料：CRISPR/Cas9介导的番茄抗晚疫病Ph-3基因定点修饰效率验证

检测标准

ISO 20188:2018 植物转基因品系分子特征检测指南

GB/T 38576-2020 人类基因表达谱芯片技术规范

ASTM F3130-18 植物病原互作反应定量测定标准

GB/T 36875-2018 核酸靶序列捕获测序质量要求

ISO 20216:2021 植物离体接种实验操作规程

NY/T 3468-2019 农作物品种抗病性鉴定技术规程

GB/T 40366-2021 昆虫抗药性基因检测技术规范

ISO 20391-2:2019 细胞遗传学分析第2部分：荧光原位杂交

SN/T 5339-2021 转基因植物实时荧光PCR检测方法

GB/T 19495.5-2018 转基因产品检测 蛋白质检测方法

检测仪器

实时荧光定量PCR仪：配置多通道光学系统，支持SYBR Green/TaqMan双探针检测，温度均一性±0.3℃，完成基因表达绝对定量

高通量测序系统：Illumina NovaSeq 6000平台，单次运行产出6Tb数据，Reads长度2×150bp，实现全转录组覆盖分析

激光共聚焦显微镜：配备405/488/561/640nm四激光系统，Z轴层切厚度0.34μm，实现亚细胞定位三维重构

蛋白质互作分析系统：Octet RED96生物分子相互作用仪，非标记实时检测结合动力学，解离常数KD检测范围10^-5-10^-12M

多功能酶标仪：Synergy H1混合型检测平台，整合荧光/化学发光/FRET检测模块，动态范围8个数量级，完成报告基因活性测定

高速冷冻离心机：最大RCF 100,000×g，温控精度±1℃，配备气密性转头，保障核酸/蛋白样品制备完整性

电泳成像系统：ChemiDoc MP化学发光成像仪，CCD像素143万，线性动态范围4.8OD，支持Western Blot精确定量

梯度PCR仪：Veriti 96孔热循环仪，升温速率5℃/秒，温度准确性±0.25℃，确保启动子片段扩增特异性

超微量分光光度计：NanoDrop One C，检测范围2-27,000 ng/μL，自动校正浊度干扰，实现核酸纯度精准判定

生物分子互作分析系统：Biacore 8K表面等离子共振仪，多通道同步检测，灵敏度0.1RU，解析转录因子-DNA结合动力学