高通量测序建库检测

检测项目

DNA/RNA完整性检测：通过电泳分析RIN/DIN值，要求RIN≥8.0，DIN≥7.5，片段完整率＞95%

文库浓度定量：采用荧光定量法，检测范围0.1-1000 ng/μL，灵敏度0.01 ng/μL

片段大小分布：毛细管电泳测定，范围100-1000 bp，分辨率±5 bp

接头连接效率：qPCR检测接头连接率，标准值≥85%，误差±3%

PCR扩增偏差：评估扩增均一性，CV值＜15%，覆盖均一性＞90%

分子标签完整性：NGS验证UMI序列正确率，标准≥99.9%

嵌合体污染：分析非特异性连接产物，阈值＜0.5%

GC含量偏差：监测GC偏好性，允许波动±5%

酶活性残留：荧光法检测限制性内切酶活性，残留量≤0.01 U/μL

游离接头浓度：电泳检测未连接接头，控制阈值＜0.1 nM

批次间重复性：RSD值验证，要求≤5%

二聚体比例：评估无效连接产物，标准＜2%

检测范围

全基因组测序文库：人类/动植物全DNA建库，片段范围150-800 bp

外显子组捕获文库：靶向探针杂交文库，覆盖度＞98%

单细胞转录组文库：基于微流控技术的单细胞标记文库

甲基化测序文库：亚硫酸盐处理文库，转化效率＞99%

宏基因组文库：环境样本混合DNA建库，宿主污染＜1%

ChIP-seq文库：染色质免疫沉淀DNA建库，富集倍数＞10

小RNA测序文库：18-30 nt小分子RNA专用接头连接

长读长测序文库：>10 kb大片段文库，片段筛选精度±5%

液态活检ctDNA文库：低频突变检测专用，输入量≥5 ng

空间转录组文库：组织切片原位条形码标记文库

病原体检测文库：多重PCR扩增病原体靶标文库

CRISPR编辑验证文库：gRNA靶向扩增文库

检测标准

ISO/IEC 17025:2017 检测实验室通用要求

ISO 20395:2018 生物样品核酸定量要求

GB/T 37872-2019 高通量测序文库质量评价通则

GB/T 34799-2017 核酸片段化参数标准

ASTM E3006-15 测序文库片段分布检测规程

YY/T 1723-2020 高通量测序用文库试剂盒标准

Illumina® Technical Note: Library Quantification

QIAseq® Targeted DNA Panel QC Guidelines

PacBio® SMRTbell Template Preparation Standard

MGI® DNBSEQ Library Construction Specification

检测仪器

Agilent 4200 TapeStation系统：执行电泳分析，检测片段分布和RIN值，精度±1 bp

Qubit 4.0荧光计：采用高灵敏度荧光染料，定量文库浓度，检测限0.01 ng/μL

Bioanalyzer 2100微流控芯片仪：分析小片段文库和RNA完整性，分辨率达3-5000 bp

QuantStudio 7 Pro qPCR仪：测定文库有效浓度和接头效率，动态范围10^7

LabChip GX Touch HT核酸分析仪：高通量自动化检测，通量＞300样/日

Covaris M220超声波破碎仪：控制片段化参数，CV值＜5%

Thermomixer C恒温混匀仪：调控酶反应温度，精度±0.1℃

Beckman Coulter Biomek i7自动化工作站：实现建库流程标准化，移液精度0.1 μL