磷酸化水平检测

检测项目

磷酸化位点鉴定：采用质谱碎片离子扫描技术，精确识别丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸修饰位点，定位精度达±0.05Da

磷酸化肽段定量：基于同位素标记（TMT/iTRAQ）或非标定量（LFQ），测定修饰肽段相对丰度，RSD≤8%

磷酸化蛋白质组分析：通过SCX-TiO2分级富集，实现低丰度磷酸化蛋白检测，覆盖率≥5000个位点/样本

激酶活性测定：使用放射性32P-ATP或荧光底物，检测单位时间内磷酸转移速率，灵敏度0.01pmol/min

去磷酸化动力学：监测磷酸酶反应进程，计算半衰期(t1/2)及米氏常数(Km)，时间分辨率0.5s

磷酸化抗体特异性验证：Western Blot交叉反应测试，要求非靶标蛋白信号强度≤5%

磷酸化水平绝对定量：配置13C/15N标记磷酸肽标准品，LC-MS/MS测定摩尔浓度，LOD 0.1 fmol/μL

空间位阻效应分析：氢氘交换质谱（HDX-MS）检测磷酸化引起的构象变化，分辨率±0.1Da

磷酸化依赖蛋白互作：表面等离子共振（SPR）检测结合常数(KD)，动态范围10-12~10-3M

磷酸化修饰稳定性：加速降解实验（40℃/75%RH）评估修饰半衰期，偏差±5%

磷酸化位点占有率：结合免疫沉淀与质谱，计算修饰位点占比，精度±2%

跨膜磷酸化监测：微流控活细胞成像系统实时追踪膜蛋白磷酸化，时间精度±30ms

检测范围

肿瘤标志物研究：EGFR/HER2等酪氨酸激酶磷酸化水平与药物响应相关性分析

神经退行性疾病模型：Tau蛋白Ser396/Ser404位点过度磷酸化定量评估

心血管药物筛选：心肌肌钙蛋白I（cTnI）磷酸化程度与心功能关联性测定

植物抗逆机制研究：MAPK信号通路关键蛋白磷酸化动态监测

疫苗佐剂效价评价：TLR通路接头蛋白MyD88磷酸化激活效率检测

细胞周期调控分析：CDK底物磷酸化水平与G1/S期转换相关性验证

病原体感染机制：宿主细胞STAT蛋白酪氨酸磷酸化信号传导研究

表观遗传调控：组蛋白H3S10磷酸化与转录激活关联性验证

代谢性疾病模型：IRS-1丝氨酸磷酸化水平与胰岛素抵抗程度量化

干细胞分化监控：多能性因子Oct4磷酸化状态多时间点追踪

药物毒性评估：肝细胞CYP450酶磷酸化修饰与代谢活性关联分析

生物制剂质控：治疗性抗体Fc段磷酸化杂质限度检测

检测标准

ISO 21309-1:2021 生物技术-磷酸化蛋白定量指南-质谱检测通则

GB/T 39699-2020 蛋白质磷酸化位点检测方法-液相色谱-串联质谱法

ASTM E3066-16 磷酸化抗体特异性验证标准方法

ISO 23157:2021 纳米材料表面磷酸化修饰表征技术规范

GB/T 39145-2020 细胞信号通路磷酸化检测流程规范

IUPAC Technical Report 2020 磷酸化肽段定量分析标准化方案

EP 10.0 2.2.63 药用蛋白制品磷酸化修饰杂质控制标准

ISO 20395:2021 生物学-激酶活性检测规范-MALDI-TOF方法

GB/T 39744-2021 组织样本磷酸化蛋白保存与处理指南

ASTM WK73412 高通量磷酸化蛋白质组学数据验证标准草案

检测仪器

Q Exactive HF-X Hybrid Quadrupole-Orbitrap质谱仪：具备120,000分辨率与18Hz扫描速率，实现复杂样本磷酸化肽段精准鉴定

PhosphoScout X3高通量磷酸化分析系统：集成自动样本富集与微流控芯片，每日处理量≥384样本

Octet RED384e分子互作仪：通过生物层干涉技术实时监测磷酸化依赖结合动力学，KD检测限10pM

PEAK Elite NanoHPLC纳升液相系统：配备钛合金流路与0.075mm毛细管柱，磷酸化肽段保留时间偏差±0.1min

Luminex xMAP FLEXMAP 3D多重检测平台：同步定量50种磷酸化靶标，动态范围达6 logs

IN Cell Analyzer 6000高内涵系统：自动获取亚细胞磷酸化定位图像，扫描精度±0.5μm

Phos-tag™ SDS-PAGE电泳装置：基于锰螯合物凝胶技术分离磷酸化异构体，迁移率差异检测限10%

Ciphergen PBSⅡc磷酸化芯片阅读仪：表面增强激光解吸电离（SELDI）专用检测，通量200点/小时

SpectraMax iD5多功能酶标仪：适配PhosFlash™荧光底物检测激酶活性，Z-factor≥0.7

UltraView VOX转盘共聚焦显微镜：FRET技术实时监测活细胞内磷酸化事件，时间分辨率10ms