甲基化水平测定

检测项目

全基因组甲基化水平分析：对样本中所有CpG二核苷酸的甲基化状态进行无偏性扫描，获取整体甲基化图谱。

特定基因启动子区甲基化检测：针对目标基因转录起始点附近的CpG岛进行高精度甲基化定量，常用于肿瘤抑制基因研究。

印记基因甲基化状态分析：检测来自父母双方等位基因的特异性甲基化模式，用于遗传性疾病诊断。

LINE-1重复序列甲基化测定：以长散布核元件-1的甲基化水平作为全基因组甲基化程度的替代性标志物。

线粒体DNA甲基化分析：研究线粒体基因组特定区域的甲基化修饰，与代谢及衰老相关。

单细胞甲基化组测序：在单个细胞水平上解析其全基因组甲基化状态，用于研究细胞异质性。

血浆游离DNA甲基化检测：对血液中循环游离DNA进行甲基化分析，应用于无创产前诊断和液体活检。

环境暴露相关甲基化生物标志物检测：分析与特定环境因素（如吸烟、污染）相关的特征性甲基化模式改变。

发育阶段特异性甲基化标记鉴定：鉴定在胚胎发育或细胞分化过程中动态变化的甲基化位点。

药物去甲基化效果评估：定量评估去甲基化药物（如地西他滨）对细胞或组织全基因组或特定区域甲基化水平的影响。

检测范围

全基因组范围：覆盖基因组中数百万个CpG位点，提供全局性视角。

候选基因区域：聚焦于一个或数个与疾病或性状相关的特定基因区域。

CpG岛及其 shores/shelves：不仅检测经典的CpG岛，也涵盖其上下游2kb（shores）和2-4kb（shelves）的区域。

增强子与绝缘子等调控元件：检测这些非启动子调控区域的甲基化状态，以理解其对基因表达的远端调控。

基因体区域：分析基因编码区（gene body）内的甲基化，其常与基因的持续表达相关。

重复序列区域：包括LINE、SINE、着丝粒卫星序列等，其甲基化丢失可能导致基因组不稳定。

单碱基分辨率：能够精确到单个胞嘧啶碱基的甲基化状态判定。

组织与细胞特异性样本：适用于从新鲜冰冻组织、福尔马林固定石蜡包埋组织到分离的特定细胞群等多种样本类型。

跨物种比较：检测范围可适用于人类、小鼠、大鼠、植物等多种生物体的基因组DNA。

动态变化监测：能够在不同时间点（如发育阶段、治疗前后）监测同一组位点甲基化水平的纵向变化。

检测方法

亚硫酸氢盐测序：金标准方法，利用亚硫酸氢盐将未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，而后通过测序区分甲基化状态。

焦磷酸测序：基于序列分析的定量技术，对经亚硫酸氢盐处理的PCR产物进行实时测序，提供精确的百分比定量。

甲基化特异性PCR：设计针对甲基化和非甲基化序列的引物，通过PCR扩增结果判断特定位点的甲基化状态。

高效液相色谱法：将DNA酶解为单核苷酸后，通过HPLC分离并定量5-甲基胞嘧啶与胞嘧啶的比例，获得整体甲基化水平。

液相色谱-串联质谱法：HPLC-MS/MS法，是定量全基因组5-mC和5-hmC等修饰的灵敏且准确的方法。

甲基化芯片分析：使用如Illumina Infinium MethylationEPIC等芯片，可同时检测数十万至百万个预选CpG位点。

简化代表性亚硫酸氢盐测序：一种经济高效的全基因组甲基化筛查方法，通过限制性酶切富集基因组代表性片段再进行测序。

靶向亚硫酸氢盐测序：利用探针杂交或扩增子测序策略，对一组感兴趣的基因或区域进行深度测序分析。

免疫沉淀法：使用5-甲基胞嘧啶特异性抗体富集甲基化的DNA片段，随后进行芯片杂交或测序分析。

限制性内切酶法：利用对甲基化敏感和不敏感的同裂酶对DNA进行切割，通过片段差异分析甲基化状态。

检测仪器设备

高通量DNA测序仪：如Illumina NovaSeq、HiSeq系列，用于全基因组、简化代表性和靶向亚硫酸氢盐测序。

焦磷酸测序仪：如Qiagen PyroMark Q96/48系列，专门用于基于焦磷酸测序原理的定量甲基化分析。

实时荧光定量PCR仪：用于进行MSP或基于探针的定量甲基化特异性PCR分析。

高效液相色谱仪：配备紫外或荧光检测器，用于分离和定量酶解后的核苷酸成分。

液相色谱-串联质谱联用仪：高灵敏度质谱仪与HPLC联用，用于精确测定核酸修饰的化学计量。

芯片扫描仪：如Illumina iScan系统，用于读取甲基化芯片杂交后的荧光信号图像。

核酸蛋白定量仪：如Nanodrop或Qubit荧光计，用于精确测定亚硫酸氢盐处理前后DNA的浓度和质量。

PCR扩增仪：用于亚硫酸氢盐处理后DNA的预扩增及文库构建过程中的各种PCR反应。

生物分析仪/片段分析仪：如Agilent Bioanalyzer或Fragment Analyzer，用于评估DNA文库的片段大小分布和质量。

磁珠纯化系统：如Beckman Coulter Biomek或手动磁力架，用于亚硫酸氢盐转化后DNA纯化及测序文库构建中的片段筛选。